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纺织生物助剂果胶酶酶活的测定办法

来历:Letou亚洲编辑部 发布时刻:2013年10月18日

1导言

跟着人们对健康纺织品需求的添加以及各国政府对环境保护强制力度的加大,在纺织印染职业中一种新式的纺织助剂———生物酶制剂的运用逐步开展起来。现在,一种依据果胶酶的新式纺织生物助剂正在运用推行中,它首要用于棉、麻的前处理工艺。因为纺织企业大都对果胶酶的生物特性不甚了解,在工艺运用进程中缺少相应的手法,使其推行受到限制。酶生机(活性)是衡量酶生物活性及含量的重要目标,因而,树立适用于纺织职业的果胶酶酶活检测办法,是非常火急和必要的。

2果胶酶的酶促作用机理

果胶酶是一类复合酶,是指分化果胶质的多种酶的总称。咱们测定的酶活值一般是这一类复合酶协同作用的归纳成果。果胶酶可分为两大类:解聚酶和果胶酯酶。解聚酶首要是经过水解作用和反式消去作用,堵截果胶和果胶酶分子α-1,4糖苷键,将果胶分子降解为小分子。果胶酯酶的作用是使果胶分子中的甲酯水解,终究构成果胶酸。

果胶质首要是由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键衔接构成的直链状聚合物。部分D-半乳糖醛酸上的羧基被甲醇酯化、构成甲酯,或被一种或多种碱部分或悉数中和。果胶质在植物的细胞组织中起着“粘合”作用,在棉纤维的初生胞壁中,果胶质含量约占9%,而麻纤维则更高。

经过果胶酶的作用,将果胶质降解为小分子物质,从纤维中游离出来,可使与其粘合在一起的其它杂质(如蜡质、蛋白质、灰份等)与纤维素完全分隔,到达棉精粹或麻脱胶的意图。

关于纺织职业,需求的是将果胶催化水解成可游离出纤维的、小分子物质的果胶酶活性(力),因而,首要测定解聚酶的生机。解聚酶对果胶分子的酶促催化作用表现为,每堵截一个果胶分子的α-1,4糖苷键,就会构成一个还原性醛基。经过测定这些还原性醛基生成的量,即可断定解聚酶的酶生机。

3测定酶生机(性)的基本原理

酶作为一种生物催化剂,其酶生机值是与其催化功率及有用(即有生物活性)酶的含量相关的。酶生机是酶在单位时刻内将底物转化为反响产品的

才能,以U(mol/时刻)表明,底物便是酶催化的反响物。一般,酶制剂的生机是以U/g酶制剂(或U/mL酶制剂)表明,把酶制剂的量和生机联络在一起,称为“比生机”。在特定条件下,经过测定单位量的某种酶制剂在单位时刻内催化满足量底物生成反响产品的量,即可测出此酶制剂的比生机。

依据酶促反响动力学的米氏学说,从酶被底物饱满的现象动身,依照“稳态平衡”假说的想象,可推导出如下公式:

产品生成速率=k3[总酶][底物]/([底物]+km)(1)

式中:[总酶]———酶的总浓度(mol/mL);

[底物]———底物浓度(mol/mL);

k3———在酶促反响的第二步,构成终究产品的速率常数;

km———米氏常数(mol/mL),其值是当酶反响速率到达最大反响速率一半时的底物浓度。

要估量[总酶],首先要固定一切可操控的独立变量,如pH值、温度等。

当[底物]>>Km时,底物对反响速率的影响可疏忽(酶饱满),酶促反响到达最大反响速率Vmax,其成果是:

产品生成速率=k3[总酶]=Vmax=U

U就成为总酶量的一种丈量。因而,能够经过测定U来反映酶制剂中有用酶蛋白的含量。

4果胶酶酶活的测定办法概述和比较

测定果胶酶酶活的办法有许多,但基本上都是运用酶促分化果胶发作的粘度下降或生成的还原性醛基来测定果胶酶酶活。这些办法归纳起来首要有粘度下降法、滴定法和分光光度法3种。本文别离选取一种较典型的测定办法加以介绍。

4.1粘度下降法

4.1.1原理

果胶溶于水后构成粘稠状溶液,其粘度和溶解度与其聚合和酯化程度有关。能够运用果胶的这种性质,测其酶生机。即在必定温度、酶下和必定反响时刻内,测定果胶溶液粘度的下降率。

4.1.2操作办法

浴中保温10min后,参加1mL酶液,继续保温,在不同时刻别离测定反响混合液流出粘度计小球的时刻。对照实验选用经热处理已失活的酶液。

4.1.3核算

粘度下降百分数可用下式表明:

粘度

下降(%)=100(To-T)/(To-Tα)(2)

式中:T、To和Tα别离为反响混合液、对照混合液和缓冲液的流出时刻(s)。

酶溶液要预先稀释,使粘度下降范围在20%~80%。在此范围内,酶浓度对数与粘度下降率成正比。以酶作用时刻为横坐标、粘度下降百分数为纵坐标做规范曲线,在图中查出粘度下降50%时对应酶的作用时刻(T1/2)。在上述条件下,引起粘度下降50%的酶量为10个果胶酶生机单位,即酶活单位=10/(T1/2/3600)。

4.2滴定法

4.2.1原理

果胶酶完全水解果胶,生成半乳糖醛酸;半乳糖醛酸可与碘(过量)反响。反响后剩下的碘可用硫代硫酸钠溶液滴定,据此可得出酶解反响发作的半乳糖醛酸的量。以生成半乳糖醛酸的量衡量果胶酶的生机。

4.2.2测定办法

取1%果胶溶液10mL,参加到5mL酶液和5mL水,调pH至3.5,在50℃水浴中坚持2h,取出加热煮沸。冷却后,取5mL反响液移入碘量瓶中,加1M碳酸钠溶液1mL,0.1N碘液5mL,摇匀,加塞,于室温下放置20min,加2N硫酸2mL,用0.05N硫代硫酸钠滴定至淡黄色,加0.5%淀粉指示剂1mL,继续滴定至蓝色消失停止。记载所耗费的硫代硫酸钠毫升数A。空白实验用10mL果胶溶液、10mL水,不加酶液,不经保温,直接取此混合物5mL于100mL三角瓶中用于滴定,记载耗费的硫代硫酸钠毫升数B。

4.2.3核算

在上述条件下,1h酶促转化果胶、生成1mg当量游离半乳糖醛酸所需的酶量定为一个酶活单位。

每毫升酶液的生机单位=(B-A)N×0.51×20.(5×2×5)(3)

式中:N———硫代硫酸钠的当量浓度;

0.51———1mg当量硫代硫酸钠相当于0.51mg当量的半乳糖醛酸;

20———分化果胶反响液的整体积数;

5、2、5———别离表明反响中参加酶液的毫升数、反响时刻、滴守时所取反响液的毫升数。

4.3分光光度法

4.3.1原理

果胶酶分化

果胶,发作带有还原性醛基的还原糖(以半乳糖醛酸计),一些显色剂可与其发作显色反响。依据色彩深浅的不同,能够经过分光光度计测定果胶酶酶活值的巨细。本文以最常用的DNS比色法介绍此检测办法,其显色剂为3,5-二硝基水杨酸。

4.3.2操作办法

取0.5%果胶溶液0.5mL参加到0.5mL酶液中,摇匀。在50℃水浴中精确反响0.5h,取出后,敏捷在沸水浴中加热5min,冷却。取0.5mL反响液移入加有0.5mLDNS试剂的试管,加4mL蒸馏水,摇匀,在沸水浴中加热5min,敏捷冷却。用分光光度计在540nm处测其吸光度值。参比液制作:加热灭活5min的0.5mL的稀释酶液与0.5mL0.5%果胶溶液充沛混合。

4.3.3核算

选用规范曲线法,制作一系列已知浓度的规范葡萄糖溶液,在540nm处测定吸光度(A),以葡萄糖浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵光标作A.C规范曲线(拜见5.2节图2)。由规范曲线可得公式:

A=斜率×C(mg葡萄糖/mL)(4)

不知道试液测定吸光度值A后,可经过上式求得C(mg葡萄糖/mL)。

在上述条件下,每小时内每毫升果胶酶酶促转化果胶生成1mg当量还原糖(以半乳糖醛酸计)所需的酶量界说为一个酶活单位。即:

果胶酶活(mg半乳糖醛酸/mL·h)=酶液稀释倍数×C(mg葡萄糖/mL)×2×194/180(5)

式中:194/180———葡萄糖换算成半乳糖醛酸的量;

2———测定中稀酶液被0.5%果胶溶液稀释的倍数。

4.43种办法的比较

将粘度下降法用来测定果胶酶的复合酶生机比较精确,但操作进程也相对杂乱,且测定灵敏度不高。滴定法设备运用简略,测验重现行好,精确度高,但测守时刻长,进程较繁琐,试剂用量较大。而分光光度法测定的灵敏度、精确度均高,重现性好,试剂用量少,尤其是操作省时、简洁。关于上述3种测定办法,依据纺织职业的特色,笔者以为分光光度法更适于纺织工作者运用。下面要点探

讨DNS比色法在实践运用中的一些具体问题。

5运用DNS比色法测定果胶酶酶活

5.1果胶溶液的制作以及酶液的稀释

果胶溶液的制作浓度以及酶液的稀释倍数是彼此联络的两个数据,它们的确认对酶活测定成果的正确性起着关键作用。经过完结以下实验,能够确认有关参数条件。

5.1.1资料与办法

5.1.1.1仪器与试剂

UV—9200分光光度计;果胶(Sigma)、果胶酶制剂(NOVO)、3,5-二硝基水杨酸、巴比妥酸、巴比妥钠。

5.1.1.2溶液制作

DNS试剂:将6.3g3,5-二硝基水杨酸、262mL2mol/LNaOH加到500mL含182g酒石酸钠的热水溶液中,再加5g苯酚及5g亚硫酸钠,待溶解、冷却后,加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中,一周后即可运用。

5.1.1.3制作巴比妥缓冲液(pH=8.6)

称取1.84g巴比妥酸,置于56~60℃水中溶化,然后参加10.3g巴比妥钠,加蒸馏水定容至1000mL。

5.1.1.4制作0.5%果胶溶液

精确称取0.5g果胶于烧杯中,用巴比妥缓冲液(pH=8.6)溶解、稀释定容至100mL。

5.1.2制作果胶酶稀释倍数与吸光度联系曲线

别离按表1的稀释倍数用蒸馏水稀释果胶酶,将稀释酶液按4.3.2测定吸光度值,以稀释倍数的倒数为横坐标,吸光度(A)为纵坐标作联系曲线(见图1)。


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